生发中心淋巴细胞凋亡与小结树突细胞关系的研究
作者：葛振华 黄守雄 周凡 武一曼* 王若愚
单位：葛振华 黄守雄 周凡 武一曼* 王若愚 福建省中医药研究院病理室；*福建中医学院病理学教研室，福州 350003
关键词：细胞凋亡；小结树突细胞；Bcl-2蛋白；生发中心
解剖学报990220
【摘要】 目的 研究人淋巴结和扁桃体生发中心内的凋亡细胞与小结树突细胞(follicular dendritic cells, FDC)之间的关系。 方法 用TUNEL和免疫细胞化学方法分别检测凋亡细胞、FDC和Bcl-2蛋白的表达。 结果 在生发中心有散在的凋亡细胞且多被巨噬细胞所吞噬；FDC主要分布在生发中心亮区，其突起彼此连结成网，网眼内充满了B淋巴细胞；Bcl-2主要分布在次级淋巴小结的帽状区，生发中心阴性。 结论 生发中心亮区的FDC形成的网状结构，有利于FDC与中心细胞的接触，只有那些有高度亲合性的中心B淋巴细胞才得以生存，生发中心凋亡细胞被认为是选择过程的结果。Bcl-2蛋白在生发中心的减少或消失有助于细胞的凋亡，而帽状区Bcl-2表达可能与保护B细胞的继续分化和抑制细胞凋亡有关。
, 百拇医药
APOPTOSIS OF B LYMPHOCYTES IN GERMINAL CENTER CORREL-ATED WITH FOLLICULAR DENDRITIC CELLS(FDCs)
Ge Zhenhua△, Huang Shouxiong, Zhou Fan, Wu Yiman*, Wang Ruoyu
(Department of Pathology, Fujian Institute of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,*Department of Pathology, Fujian College of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the apoptotic cells and follicular dendritic cells (FDCs) in germinal center of human lymph nodes and tonsils. Methods TUNEL and immunocytochemical methods have been used to detect the apoptotic cells, FDCs and Bcl-2 protein. Results Apoptotic cells displaying in germinal center were almost phagocytozed by macrophages. The FDCs principally located in the light zone of germinal center. They have rich dendritic processes to form dense networks. Bcl-2 protein mainly distributed in the mantle zone of secondary follicles, while germinal center was negative. Conclusions FDCs formed in networks in light zone were facilitated to form the contact between centrocytes and FDC, and led to the selection of high affinity centrocytes by rescusing. Apoptosis might be considered as the result of selection process, and lack of Bcl-2 protein might be contributed to apoptosis. However, the Bcl-2 in the mantle zone was assumed to help B cells continue differentiation and inhibit the induction of apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Apoptosis; Follicular dendritic cells(FDCs); Bcl-2 protein, Germinal center
生发中心主要由B细胞构成，也是B细胞分化成熟的场所。在B细胞增生过程中，免疫球蛋白的基因可变区产生突变，部分细胞在选择过程中被淘汰，这些被淘汰的细胞很快进入凋亡。近年来，体外研究证明，小结树突细胞(FDC)能拯救B淋巴细胞[1，2]，Bcl-2蛋白的表达也能抑制细胞凋亡[3]。至于在生理情况下，生发中心内的凋亡细胞与FDC以及Bcl-2蛋白表达间的关系，则报道甚少，这就是本研究的目的。
材料和方法
1.组织
5例手术摘除的人扁桃体和5例腹腔手术病人的淋巴结，在术后2h内用10%福尔马林固定，常规脱水，透明，石蜡包埋，切5μm厚切片，用0.1%的多聚赖氨酸粘片。
, http://www.100md.com
2.免疫细胞化学染色
凋亡细胞染色用TdT缺口末端标记法，用兔抗牛S-100抗体(Dako公司)免疫细胞化学法显示FDC。Bcl-2也用免疫细胞化学SP间接法染色，但在染色前使用高温高压修复组织抗原，其他步骤按免疫细胞化学方法进行。对照片用PBS代替第1抗体，其他步骤同实验片。
结果和讨论
TUNEL染色的凋亡细胞呈紫黑色，圆形，染色质浓缩，对照片阴性。位于淋巴结和扁桃体生发中心的凋亡细胞，呈散在分布(图1)，亮区和暗区内均可见。凋亡细胞大都被巨噬细胞所吞噬，一个巨噬细胞内可见到1～3个凋亡细胞，但帽状区内未见凋亡细胞。淋巴结和扁桃体生发中心的树状突细胞(FDC)，S-100抗体染色呈强阳性反应，胞质和突起深染，帽状区未见其分布，对照片阴性。生发中心树突细胞多位于亮区(图2)，暗区也可见少量树突细胞。亮区内树突细胞的突起彼此联接成网(图3)，网眼中充满了淋巴细胞。淋巴结和扁桃体淋巴小结帽状区的淋巴细胞及其他部位的淋巴细胞呈Bcl-2阳性(图4)。此外，个别扁桃体的生发中心也有散在或成团的Bcl-2阳性细胞(图5)。Bcl-2阳性反应位于胞质周围(图6)，对照片阴性。淋巴小节生发中心的细胞凋亡是B细胞生理性选择过程的结果。生发中心暗区的成中心母细胞分裂增生快，但是细胞数目增大并不显著[4]，也象胸腺内的T细胞一样经过阳性和阴性选择来删除多余的淋巴细胞，从而维持了正常的细胞数量。生发中心亮区只有那些有高度亲合性的中心B细胞才得以生存，故在生发中心内看到有较多的凋亡细胞。在某些情况下，细胞凋亡与组织内细胞高度增生有关，是一种保护性机制，阻止部分损伤或进入程序性死亡的细胞增生。Petrasch[4]等报道FDC的突起可包绕几个淋巴细胞，形成FDC-B细胞直接接触。从我们的资料来看，生发中心的淋巴细胞排列紧密，虽然难以分清FDC与淋巴细胞形成的集落，但是体外实验证明，FDC形成的网络以及它们的抗原可直接与B细胞形成免疫复合物被覆小体(immune complex coated bodies, Iccosome)。FDC首先选择那些免疫球蛋白Fc受体有高度亲合力的中心B细胞结合，而对抗原低亲合力的中心B细胞则在原位凋亡[1]。另外证明，防止细胞凋亡还依赖FDC-B细胞间的物理反应，借助于粘附分子通路的建立，如FDC细胞内粘附分子(ICAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM-1)，分别与B淋巴细胞功能协同抗原(LFA-1)或晚期激活抗原-4(VLA-4)结合，结合的B细胞免于凋亡[2]，但FDC拯救B淋巴细胞的机理还不清楚。至于在暗区出现的FDC是另一亚群，因为它们的免疫表型与亮区的FDC不同[1]。FDC通常有各种不同的功能，如对B细胞的增生、分化、成熟选择等，超微结构显示每个滤泡的层次(follicular zone)结构是不同的。Bcl-2与程序性细胞死亡的调控有关，近年的研究证明，Bcl-2蛋白的表达不仅限于滤泡性淋巴瘤，也见于其他肿瘤和正常组织。我们的资料证实，Bcl-2蛋白分布是有选择性的。Bcl-2蛋白在生发中心的减少或消失，有助于细胞凋亡。至于在扁桃体生发中心亮区出现的少数Bcl-2阳性细胞，可能是由于炎症反应的结果，局部的吞噬细胞分泌一种与宿主防御有关的IL-1，它是一种细胞激动素，可诱发Bcl-2的表达。体外实验证明，生发中心细胞与重组的CD23再加上IL-1一起培养时，诱发Bcl-2，使细胞不会进入凋亡。但Liu等认为在亮区少数Bcl-2阳性细胞是被拯救出来的B细胞，它们是即将离开生发中心进入帽状区的B细胞，Bcl-2蛋白是由亮区顶部的FDC用信号诱发而产生，其目的是保证中心B细胞进一步分化为记忆B细胞或浆母细胞[5]。此外在暗区的成中心母细胞在细胞周期中也不表达Bcl-2蛋白，仍然维持着低水平的细胞凋亡，并继续分化为中心B细胞。这是由于成中心母细胞依赖于微环境中获得的信号，使其在体内免于凋亡，是独立于Bcl-2和FDCs以外拯救细胞凋亡的另一途径，但其机理尚不清楚。至于在帽状区的Bcl-2阳性细胞，说明Bcl-2在抑制细胞凋亡的同时，可能还与促进细胞分化有一定关系，另外在成熟的细胞中Bcl-2的表达对维持细胞永久性生存具有重要意义。
, 百拇医药
图1 示淋巴结生发中心(GC)的凋亡细胞被巨噬细胞吞噬(↑)×200
Fig.1 Lymphonode section stained with TUNEL, showing the apoptotic cells(↑) displayed in the germinal center(GC), and phagocytosed by macrophages. ×200
图2 扁桃体切片，FDCs(↑)位于生发中心的亮区(L)，D为暗区S-100抗体染色×200
Fig.2 Tonsil section stained with S-100 antibody, showing the FDC (↑) in the light zone (L). Dark zone(D).×200
, 百拇医药
图3 是图2的放大，位于亮区(L)的FDCs(↑)的突起形成网状结构(*) ×400
Fig.3 Magnification of Fig.2, FDCs in the light zone (L) formed a networks(*). ×400
图4 淋巴结切片，示Bcl-2阳性反应主要位于淋巴小结的帽状区(M)，生发中心(GC)阴性 ×100
Fig.4 Lymphnode section stained with Bcl-2 antibody, showing the Bcl-2 positive cells localized in the mantle zone (M), but the germinal center (GC) was lack of Bcl-2 reaction. ×200
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图5 扁桃体切片，Bcl-2阳性细胞团(↑)位于生发中心(GC)的亮区(L).帽状区(M) ×200
Fig.5 Tonsil section, showing Bcl-2 positive cells in germinal center (GC), and formed a cluster (↑). Mantle zone(M). ×400
图6 是图5的放大，示帽状区(M)Bcl-2阳性细胞，GC.生发中心 ×400
Fig.6 Magnification of Fig.5, showing the Bcl-2 positive cells at mantale zone (M), GC:germinal center ×400
参考文献
, 百拇医药 [1]Orui H, Yamakwa M, Imai Y.Proliferation and apoptosis of follicular lymphocytes: relationship to follicular dendritic cell-associated clusters. Immunology, 1997, 90(3):489
[2]Lindhout E, Mevissen MLCM, Kwekkeboom J et al: Direct evidence that human follicular dendrtic cells(FDC) rescue germinal centre B cells from death by apoptosis. Clin Exp Immunol, 1993, 91(2):330
[3]Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol 1994, 124(1-2):1
, 百拇医药
[4]Petrasch S, Kosco MH, Petreze-Alvarez C, et al. Proliferation of germinal center B lymphocytes in vitro by direct membrane contact with follicular dendritic cells. Immunobiol, 1991, 183(4):451
[5]Liu YJ, Masson DY, Johnson GD, et al. Germinal center cells express Bcl-2 protein after activation by signals which prevent their entry into apoptosis. Eur J Immunol, 1991, 21(8):1905, http://www.100md.com
单位：葛振华 黄守雄 周凡 武一曼* 王若愚 福建省中医药研究院病理室；*福建中医学院病理学教研室，福州 350003
关键词：细胞凋亡；小结树突细胞；Bcl-2蛋白；生发中心
解剖学报990220
【摘要】 目的 研究人淋巴结和扁桃体生发中心内的凋亡细胞与小结树突细胞(follicular dendritic cells, FDC)之间的关系。 方法 用TUNEL和免疫细胞化学方法分别检测凋亡细胞、FDC和Bcl-2蛋白的表达。 结果 在生发中心有散在的凋亡细胞且多被巨噬细胞所吞噬；FDC主要分布在生发中心亮区，其突起彼此连结成网，网眼内充满了B淋巴细胞；Bcl-2主要分布在次级淋巴小结的帽状区，生发中心阴性。 结论 生发中心亮区的FDC形成的网状结构，有利于FDC与中心细胞的接触，只有那些有高度亲合性的中心B淋巴细胞才得以生存，生发中心凋亡细胞被认为是选择过程的结果。Bcl-2蛋白在生发中心的减少或消失有助于细胞的凋亡，而帽状区Bcl-2表达可能与保护B细胞的继续分化和抑制细胞凋亡有关。
, 百拇医药
APOPTOSIS OF B LYMPHOCYTES IN GERMINAL CENTER CORREL-ATED WITH FOLLICULAR DENDRITIC CELLS(FDCs)
Ge Zhenhua△, Huang Shouxiong, Zhou Fan, Wu Yiman*, Wang Ruoyu
(Department of Pathology, Fujian Institute of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,*Department of Pathology, Fujian College of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the apoptotic cells and follicular dendritic cells (FDCs) in germinal center of human lymph nodes and tonsils. Methods TUNEL and immunocytochemical methods have been used to detect the apoptotic cells, FDCs and Bcl-2 protein. Results Apoptotic cells displaying in germinal center were almost phagocytozed by macrophages. The FDCs principally located in the light zone of germinal center. They have rich dendritic processes to form dense networks. Bcl-2 protein mainly distributed in the mantle zone of secondary follicles, while germinal center was negative. Conclusions FDCs formed in networks in light zone were facilitated to form the contact between centrocytes and FDC, and led to the selection of high affinity centrocytes by rescusing. Apoptosis might be considered as the result of selection process, and lack of Bcl-2 protein might be contributed to apoptosis. However, the Bcl-2 in the mantle zone was assumed to help B cells continue differentiation and inhibit the induction of apoptosis.
, 百拇医药
【Key words】 Apoptosis; Follicular dendritic cells(FDCs); Bcl-2 protein, Germinal center
生发中心主要由B细胞构成，也是B细胞分化成熟的场所。在B细胞增生过程中，免疫球蛋白的基因可变区产生突变，部分细胞在选择过程中被淘汰，这些被淘汰的细胞很快进入凋亡。近年来，体外研究证明，小结树突细胞(FDC)能拯救B淋巴细胞[1，2]，Bcl-2蛋白的表达也能抑制细胞凋亡[3]。至于在生理情况下，生发中心内的凋亡细胞与FDC以及Bcl-2蛋白表达间的关系，则报道甚少，这就是本研究的目的。
材料和方法
1.组织
5例手术摘除的人扁桃体和5例腹腔手术病人的淋巴结，在术后2h内用10%福尔马林固定，常规脱水，透明，石蜡包埋，切5μm厚切片，用0.1%的多聚赖氨酸粘片。
, http://www.100md.com
2.免疫细胞化学染色
凋亡细胞染色用TdT缺口末端标记法，用兔抗牛S-100抗体(Dako公司)免疫细胞化学法显示FDC。Bcl-2也用免疫细胞化学SP间接法染色，但在染色前使用高温高压修复组织抗原，其他步骤按免疫细胞化学方法进行。对照片用PBS代替第1抗体，其他步骤同实验片。
结果和讨论
TUNEL染色的凋亡细胞呈紫黑色，圆形，染色质浓缩，对照片阴性。位于淋巴结和扁桃体生发中心的凋亡细胞，呈散在分布(图1)，亮区和暗区内均可见。凋亡细胞大都被巨噬细胞所吞噬，一个巨噬细胞内可见到1～3个凋亡细胞，但帽状区内未见凋亡细胞。淋巴结和扁桃体生发中心的树状突细胞(FDC)，S-100抗体染色呈强阳性反应，胞质和突起深染，帽状区未见其分布，对照片阴性。生发中心树突细胞多位于亮区(图2)，暗区也可见少量树突细胞。亮区内树突细胞的突起彼此联接成网(图3)，网眼中充满了淋巴细胞。淋巴结和扁桃体淋巴小结帽状区的淋巴细胞及其他部位的淋巴细胞呈Bcl-2阳性(图4)。此外，个别扁桃体的生发中心也有散在或成团的Bcl-2阳性细胞(图5)。Bcl-2阳性反应位于胞质周围(图6)，对照片阴性。淋巴小节生发中心的细胞凋亡是B细胞生理性选择过程的结果。生发中心暗区的成中心母细胞分裂增生快，但是细胞数目增大并不显著[4]，也象胸腺内的T细胞一样经过阳性和阴性选择来删除多余的淋巴细胞，从而维持了正常的细胞数量。生发中心亮区只有那些有高度亲合性的中心B细胞才得以生存，故在生发中心内看到有较多的凋亡细胞。在某些情况下，细胞凋亡与组织内细胞高度增生有关，是一种保护性机制，阻止部分损伤或进入程序性死亡的细胞增生。Petrasch[4]等报道FDC的突起可包绕几个淋巴细胞，形成FDC-B细胞直接接触。从我们的资料来看，生发中心的淋巴细胞排列紧密，虽然难以分清FDC与淋巴细胞形成的集落，但是体外实验证明，FDC形成的网络以及它们的抗原可直接与B细胞形成免疫复合物被覆小体(immune complex coated bodies, Iccosome)。FDC首先选择那些免疫球蛋白Fc受体有高度亲合力的中心B细胞结合，而对抗原低亲合力的中心B细胞则在原位凋亡[1]。另外证明，防止细胞凋亡还依赖FDC-B细胞间的物理反应，借助于粘附分子通路的建立，如FDC细胞内粘附分子(ICAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM-1)，分别与B淋巴细胞功能协同抗原(LFA-1)或晚期激活抗原-4(VLA-4)结合，结合的B细胞免于凋亡[2]，但FDC拯救B淋巴细胞的机理还不清楚。至于在暗区出现的FDC是另一亚群，因为它们的免疫表型与亮区的FDC不同[1]。FDC通常有各种不同的功能，如对B细胞的增生、分化、成熟选择等，超微结构显示每个滤泡的层次(follicular zone)结构是不同的。Bcl-2与程序性细胞死亡的调控有关，近年的研究证明，Bcl-2蛋白的表达不仅限于滤泡性淋巴瘤，也见于其他肿瘤和正常组织。我们的资料证实，Bcl-2蛋白分布是有选择性的。Bcl-2蛋白在生发中心的减少或消失，有助于细胞凋亡。至于在扁桃体生发中心亮区出现的少数Bcl-2阳性细胞，可能是由于炎症反应的结果，局部的吞噬细胞分泌一种与宿主防御有关的IL-1，它是一种细胞激动素，可诱发Bcl-2的表达。体外实验证明，生发中心细胞与重组的CD23再加上IL-1一起培养时，诱发Bcl-2，使细胞不会进入凋亡。但Liu等认为在亮区少数Bcl-2阳性细胞是被拯救出来的B细胞，它们是即将离开生发中心进入帽状区的B细胞，Bcl-2蛋白是由亮区顶部的FDC用信号诱发而产生，其目的是保证中心B细胞进一步分化为记忆B细胞或浆母细胞[5]。此外在暗区的成中心母细胞在细胞周期中也不表达Bcl-2蛋白，仍然维持着低水平的细胞凋亡，并继续分化为中心B细胞。这是由于成中心母细胞依赖于微环境中获得的信号，使其在体内免于凋亡，是独立于Bcl-2和FDCs以外拯救细胞凋亡的另一途径，但其机理尚不清楚。至于在帽状区的Bcl-2阳性细胞，说明Bcl-2在抑制细胞凋亡的同时，可能还与促进细胞分化有一定关系，另外在成熟的细胞中Bcl-2的表达对维持细胞永久性生存具有重要意义。
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图1 示淋巴结生发中心(GC)的凋亡细胞被巨噬细胞吞噬(↑)×200
Fig.1 Lymphonode section stained with TUNEL, showing the apoptotic cells(↑) displayed in the germinal center(GC), and phagocytosed by macrophages. ×200
图2 扁桃体切片，FDCs(↑)位于生发中心的亮区(L)，D为暗区S-100抗体染色×200
Fig.2 Tonsil section stained with S-100 antibody, showing the FDC (↑) in the light zone (L). Dark zone(D).×200
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图3 是图2的放大，位于亮区(L)的FDCs(↑)的突起形成网状结构(*) ×400
Fig.3 Magnification of Fig.2, FDCs in the light zone (L) formed a networks(*). ×400
图4 淋巴结切片，示Bcl-2阳性反应主要位于淋巴小结的帽状区(M)，生发中心(GC)阴性 ×100
Fig.4 Lymphnode section stained with Bcl-2 antibody, showing the Bcl-2 positive cells localized in the mantle zone (M), but the germinal center (GC) was lack of Bcl-2 reaction. ×200
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图5 扁桃体切片，Bcl-2阳性细胞团(↑)位于生发中心(GC)的亮区(L).帽状区(M) ×200
Fig.5 Tonsil section, showing Bcl-2 positive cells in germinal center (GC), and formed a cluster (↑). Mantle zone(M). ×400
图6 是图5的放大，示帽状区(M)Bcl-2阳性细胞，GC.生发中心 ×400
Fig.6 Magnification of Fig.5, showing the Bcl-2 positive cells at mantale zone (M), GC:germinal center ×400
参考文献
, 百拇医药 [1]Orui H, Yamakwa M, Imai Y.Proliferation and apoptosis of follicular lymphocytes: relationship to follicular dendritic cell-associated clusters. Immunology, 1997, 90(3):489
[2]Lindhout E, Mevissen MLCM, Kwekkeboom J et al: Direct evidence that human follicular dendrtic cells(FDC) rescue germinal centre B cells from death by apoptosis. Clin Exp Immunol, 1993, 91(2):330
[3]Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol 1994, 124(1-2):1
, 百拇医药
[4]Petrasch S, Kosco MH, Petreze-Alvarez C, et al. Proliferation of germinal center B lymphocytes in vitro by direct membrane contact with follicular dendritic cells. Immunobiol, 1991, 183(4):451
[5]Liu YJ, Masson DY, Johnson GD, et al. Germinal center cells express Bcl-2 protein after activation by signals which prevent their entry into apoptosis. Eur J Immunol, 1991, 21(8):1905, http://www.100md.com